단백질 탐침 항체

 

유전자 발현 및 기능을 알기 위해서는 DNA와 RNA 뿐만 아니라 특정 단백질의 검출도 필요해집니다. 이러한 연구에서는 특이한 단백질과 선택적으로 작용할 수 있는 인자로서 항체가 핵산 탐침을 대신하게 됩니다. 항체는 면역계 세포(B림프구)에 의해 생성되는 단백질로, 바이러스의 외투 단백질처럼 숙주가 외래 물질로 인식하는 분자(항원)와 반응합니다. 척추동물의 면역계는 수백만 종류의 항체를 생산할 수 있는데, 각 항체는 단백질, 탄수화물 및 비생물 분자 등의 독특한 항원을 선택적으로 인식합니다. 하나의 림프구는 한 종류의 항체를 생성하지만, 서로 다른 림프구의 항체 유전자는 면역계 발달 과정 동안에 일어나는 계획된 유전자 재배열의 결과로 다양합니다. 이 다양성은 서로 다른 항원들에 반응하도록 서로 다른 항체 유전자를 가진 림프구들을 갖추게 합니다. 

항체는 외래 단백질을 동물에 주사하여 생성할 수 있습니다. 예를 들면, 인체 단백질에 대한 항체는 대개 토끼에서 만듭니다. 이렇게 면역시킨 동물의 혈청 내에는 주사한 항원의 여러 부위와 반응하는 항체의 혼합물이 들어 있습니다. 그러나 한 종류의 항체(단일클론 항체)도 면역시킨 동물(주로 마우스)의 B 림프구의 클론세포주를 배양하여 만들 수 있습니다. 그 이유는 각 림프구는 단지 한 종류의 항체를 생성하도록 계획되어 있기 때문입니다.

 

 

 

면역 블로팅(Western blotting)

 

Western blotting은 세포 추출물 중의 단백질을 전기영동에 의해 크기에 따라 분리합니다. 그러나 단백질은 각각 그 형태와 전하가 다르기 때문에 핵산 전기영동법을 약간 변형해서 사용해야 합니다. 단백질은 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)으로 알려진 방법에 따라 분리하는데, 이 방법에서는 음이온 계면활성제인 sodium dodecyl sulfate(SDS)를 포함한 용액에 단백질을 용해시킵니다. 이때, 단백질은 다수의 SDS 분자와 결합하게 되는데, 이는 단백질을 변성시키고 단백질 분자 전체에 걸쳐 음전하를 띠게 합니다. 이러한 조건에서 모든 단백질은 양극으로 이동하고, 이동 속도는 핵산과 마찬가지로 오직 크기에 의해 결정됩니다. 전기영동 후에 단백질을 여과지로 옮기고 목적 단백질에 대한 항체와 반응시킵니다. 여과지에 결합된 형체는 화학발광과 같은 다양한 방법으로 검출할 수 있는데, 이로 인해 항체의 표적 단백질을 찾아낼 수 있습니다.

 

@ Western blotting 과정

 

 

 

면역침강법(Immunoprecipitation)

 

Immunoprecipitation에서도 항체는 자기와 반응하는 단백질의 분리에 이용됩니다. 보통 세포의 단백질을 표지하기 위해 세포를 방사성 아미노산과 함께 배양합니다. 이렇게 표지된 세포 추출액을 항체와 반응시키면 항체는 항원을 가진 표적 단백질과 결합하게 됩니다. 이렇게 결합된 항원-항체 복합체를 분리하여 전기영동을 하면 방사능을 가진 항원을 검출할 수 있습니다. 또한, 상호작용하는 두 단백질 공면역침강(Co-immunoprecipitation)에 의해 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 데도 사용할 수 있습니다. 세포 내에서 한 단백질과 정상적으로 작용하는 단백질이 결합된 채로 남아있을 수 있는 조건에서 세포의 단백질을 면역침강 시키는 것입니다. 그리고 면역침강된 단백질 복합체는 젤 전기영동이나 질량분석 등으로 분석하여 항체와 직접 작용한 단백질뿐만 아니라 세포 추출물에서 그 단백질과 결합하는 다른 단백질들도 확인할 수 있습니다.